光療診斷學近年來引起了人們的極大興趣，因為它允許在光照開始時進行實時診斷和同時進行原位治療，從而為癌癥研究開辟了一條新的途徑。目前人們不斷探索各種診斷成像和治療模式，以構建光療系統(tǒng)。在各種診斷技術中，熒光成像（FLI）具有靈敏度高、響應快、無創(chuàng)性等顯著優(yōu)點，可在現場和時間上直觀顯示，但由于穿透深度不足，其在體內的應用受到嚴重限制。相比之下，光聲成像(PAI)作為另一種光觸發(fā)診斷方案，能夠提供具有非常高成像深度的圖像，并以微觀空間分辨率描繪深部腫瘤輪廓，但缺乏靈敏度。
FLI與PAI的整合將明確有助于通過協(xié)調成像靈敏度、空間分辨率和穿透深度來獲得豐富而精確的腫瘤信息。光療法包括光動力療法（PDT）和光熱療法（PTT），是一種光可控、無創(chuàng)、有效的治療手段，PTT過程中產生的熱信號也可以通過光熱成像系統(tǒng)（PTI）捕獲，從而提供良好的溫度敏感性和實時監(jiān)控的可能性。但是，由于PDT腫瘤微環(huán)境的缺氧性和PTT的熱休克效應，PDT或PTT單獨使用的效率通常是不令人滿意的。
PDT和PTT的合作被認為是突破性的策略，可以克服各自的缺點，實現協(xié)同效應，提高治療效果。例如，PTT可通過提高血流量改善腫瘤組織的供氧，從而促進PDT效應，從而進一步消除PTT中的耐熱腫瘤細胞。因此，巧妙地構建多功能光療系統(tǒng)，允許同時進行多模式成像和協(xié)同光療將是至關重要的。
最近，唐本忠院士和深圳大學王東副教授在《Advanced Materials》發(fā)表了題為“An All‐Round Athlete on the Track of Phototheranostics: Subtly Regulating the Balance between Radiative and Nonradiative Decays for Multimodal Imaging‐Guided Synergistic Therapy”的通訊，報道了了一種簡單而強大的基于聚集誘導發(fā)射(AIE)活性熒光團的光療法。由于其強大的電子供體-受體相互作用和精細調制分子內運動, 基于AIE熒光團的納米顆粒同時顯示出明亮的近紅外II（NIR–II）熒光發(fā)射、有效的活性氧生成以及在近紅外輻射下的高光熱轉換效率，表明輻射和非輻射能量耗散之間實現了平衡。
此外，NIR-II FLI-PAI-PTI三模成像引導下PDT-PTT協(xié)同治療的空前表現被精確的腫瘤診斷和完全的腫瘤清除結果所證明。因此，這項研究帶來了一個新的見解，以發(fā)展優(yōu)越的多功能光療法用于癌癥治療。
1.?分子設計與性能
通常由于電子帶隙的減小和系間竄越（ISC）過程的加強，電子供體-受體（D–A）相互作用整合到共軛結構生色團中可以顯著促進紅移吸收/發(fā)射和ROS生成。
在因此，他們設計了化合物TI、TSI和TSSI，由1,3-雙（雙氰甲基）吲哚部分（作為受體）、三苯胺（TPA）單元（供體D）和/或噻吩段（D和π橋）組成，顯示出極強的D-A相互作用和不同程度的π-共軛。選擇TPA部分是因為它不僅可以作為強電子供體，而且可以作為分子轉子。
此外，TPA段高度扭曲的構象會延長分子間的距離，即使在聚集態(tài)也會導致相對松散的分子間堆積，這有助于保留部分分子內旋轉，從而有利于納米粒子內部的發(fā)熱。此外，這些化合物的螺旋槳狀扭曲結構還可以通過顯著減少分子間π–π堆積而有效地抑制粒子內聚集體中的熒光猝滅。
另一方面，與分子內旋轉相比，作為另一種高頻分子運動的分子內伸縮振動對外界環(huán)境約束的敏感性較低，對提高產熱極為有利。因此選擇了兩個丙二腈改性二氫化茚作為電子受體，不僅因為它的電子極度缺乏，而且主要考慮到結構中碳氮鍵的劇烈拉伸振動，并且這無疑有利于聚集態(tài)分子內的運動，很有希望作為分子內旋轉的有力補充，以保證納米粒子內PTT-PTI-PAI的良好效率。此外，TSI和TSSI的共軛主鏈中的噻吩段被設計成進一步增強供電子的性質，從而顯著地使吸收/發(fā)射波長紅移。
此外，在TI、TSI和TSSI中逐漸增強的D–A強度也可以顯著提高具有細胞毒性的ROS的產生能力，從而提高PDT的效率。同時，噻吩環(huán)的引入也有望擴大TPA單元與大分子電子受體之間的分子內距離，進一步提高聚集態(tài)分子內旋轉和光熱轉化效率。因此，具有最大D–A強度和聚集態(tài)分子內運動的TSSI化合物將是構建具有NIR–II發(fā)射的多功能光療法的最有希望的候選材料。
圖1 分子結構、納米制造和多功能光療應用的示意圖。A）化合物的分子結構，包括TI，TSI和TSSI。B） 納米沉淀法制備TSSI納米粒子。C） 說明協(xié)調的光物理過程和TSSI NP在NIR-II FLI-PAI-PTI三模成像引導下的PDT-PTT協(xié)同癌癥治療中的應用。
TI、TSI和TSSI的光學性質。得益于從TI到TSSI的D–A強度的有序增強，這些化合物在固態(tài)中逐漸顯示出620至664 nm的深紅色最大吸收峰。這三種化合物在純CHCl3溶液中都有微弱的發(fā)射，發(fā)射強度隨著混合溶劑中正己烷含量的增加而逐漸增大，表明了它們典型的AIE特性。研究了其在DMSO溶液中的光熱轉化行為，在660nm激光照射5min后，TI、TSI和TSSI的溫度迅速有效地升高，分別在47、54和61°C下達到穩(wěn)定，證明由于溶液中分子的振動運動，激子能量主要通過熱失活途徑耗散。
圖2 TI，TSI，TSSI和相應納米粒子的光物理、光動力和光熱特性。A） 固態(tài)歸一化吸收光譜。B） 相對發(fā)射強度（I/I?0）與己烷分數的關系圖。I?0和I分別是CHCl3和CHCl3/正己烷混合物中熒光強度的峰值。C） 660nm激光輻照下AIEgens（100×10?6M）在DMSO溶液中的光熱轉化行為比較。D）?納米粒子的尺寸分布和E）TEM圖像。F） 這些納米粒子在水溶液中的歸一化吸收光譜和G）歸一化發(fā)射光譜。H） 在660nm激光照射下，這些納米粒子（1×10?6M AIEgen）的ROS生成。I)比較這些納米粒子(100×10?6?M AIEgen)在660 nm激光照射下水溶液中的光熱轉換行為。
為了制備生物相容性和分散性良好的AIE納米粒子，疏水性TI、TSI和TSSI通過納米沉淀法直接用兩親性共聚物DSPE-mPEG2000封裝。納米粒子表現出廣泛而強烈的吸收，尤其是TSSI?納米粒子的吸收幾乎覆蓋了整個NIR-I范圍，尾部延伸至1000 nm。近紅外區(qū)的長吸收波長是光療診斷學在體內應用的重要前提之一，因為與紫外或可見光相比，它能深入組織，對組織造成的損傷更小。
研究了AIE納米粒子的ROS生成效率。在TSSI納米粒子存在下，經5min激光照射后，指示劑DCFH的發(fā)射強度達到250倍以上，TSSI納米粒子的ROS產生效率明顯優(yōu)于TI和TSI納米粒子，這可能是由于TSSI的D-A相互作用較強。評估了TI、TSI和TSSI 納米粒子的光熱效應。它們的溶液溫度在近紅外激光照射100秒內迅速升高，TSSI納米粒子的溫度升幅（ΔT≈28°C）高于TI納米粒子（ΔT≈18°C）和TSI納米粒子（ΔT≈24°C）。TSSI納米粒子的光熱轉換效率約為46.0%，高于之前報告的絕大多數光熱劑。
2.?光療應用
TSSI納米粒子對小鼠乳腺癌4T1細胞的體外協(xié)同光療效果。TSSI NP在孵育3小時內大量內化到4T1細胞，并被捕獲到溶酶體中。研究了近紅外激光誘導的TSSI納米粒子對4T1腫瘤細胞的殺傷作用。首先，在黑暗條件下，即使在高濃度下，TSSI NP也未發(fā)現對4T1腫瘤細胞和正常細胞（LO2和NIH 3T3）的明顯毒性，表明其具有非凡的生物相容性。在NIR照射（660 nm，0.3 W cm?2，5 min）后，TSSI NP對4T1細胞具有超高的抑瘤效果，IC50（導致50%生長抑制的濃度）值低至7.3μg mL?1。這是因為活細胞可以有效地產生ROS，有效促進TSSI NP對4T1細胞的高光毒性。
圖3 TSSI-納米粒子對4T1腫瘤細胞株的細胞內吞及協(xié)同抑瘤作用。A） 用TSSI NP（10μg mL?1?TSSI）孵育3 h后的4T1細胞的CLSM圖像。B）用TSSI NP和TSSI NP孵育24 h后的4T1細胞的細胞活力通過CCK‐8測定（平均值±SD，n=6）。C） 用PBS、PBS（+L，12h后）、TSSI NP和TSSI NP處理13 h（50μg mL?1?TSSI）的4T1細胞的細胞內ROS水平（上排）和活/死細胞染色（下排）。
TSSI納米粒子的三模（NIR‐II FLI‐PAI‐PTI）成像能力。小鼠在給藥TSSI納米粒子（0小時）前用1020nm的長程（LP）濾光片顯示出極微弱的自體熒光。在注射后6h，腫瘤區(qū)域出現強烈的NIR-II熒光信號，表明在EPR效應的驅動下，TSSI-NPs在腫瘤組織中顯著積聚。研究了體內產生光聲（PA）信號的能力。注射前（0h）檢測到微弱的PA信號，隨著時間的推移，腫瘤部位的PA強度明顯增強，在注射后12小時達到穩(wěn)定。因此PAI可以作為NIR-II-FLI的有力補充成像方式。然后在靜脈注射TSSI納米粒子12 h后，用660nm激光對荷瘤小鼠進行體內光熱實驗，用紅外熱像儀實時監(jiān)測過程溫度。2分鐘內近紅外輻射后腫瘤組織的溫度可以上升至50℃左右，這表明PTT應用的巨大潛力。
圖4 通過全身給藥，體內多模式成像引導TSSI納米粒子對4T1荷瘤BALB/c裸鼠的協(xié)同治療效果。A） 給藥TSSI NP后不同監(jiān)測時間腫瘤組織的NIR-II FL圖像（上排）和PA圖像（下排）。B） TSSI納米粒子注射后12小時連續(xù)近紅外輻射期間腫瘤小鼠的熱圖像、加熱溫度（在腫瘤部位）。C） 不同治療方法的荷瘤小鼠腫瘤生長曲線的時間依賴性（n=6，*p<0.001）。D） 不同治療后第15天采集的腫瘤照片。E） 腫瘤組織H&E、TUNEL、CD31染色分析及不同治療后肺組織H&E染色分析。TUNEL和CD31陽性細胞分別被染成紅色和綠色。
評估TSSI納米粒子的體內殺瘤活性。對4T1移植瘤BALB/c裸鼠全身給藥，在此期間只進行一次注射，然后在注射后12小時僅進行一次NIR照射。在治療后的第3天，幾乎所有用TSSI納米粒子加NIR照射的小鼠實體瘤都被消除了。隨后，通過組織學和免疫組化研究進一步分析體內治療機制。近紅外激光誘導的協(xié)同熱療和基于TSSI納米粒子的ROS可導致腫瘤組織廣泛破壞，腫瘤細胞出現明顯異常，空洞多，核固縮明顯。
TSSI納米粒的潛在全身毒性。在治療過程中，每三天測量一次所有治療小鼠的體重，未發(fā)現各組的體重有明顯變化。15天后處死小鼠，采集血液進行血液學和血液生化分析。與生理鹽水組相比，肝功能指標和腎功能指標的血液生化參數均較生理鹽水組高，TSSI 納米粒子給藥組的尿素氮（BUN）似乎正常，差異無統(tǒng)計學意義，表明TSSI?納米粒子沒有明顯的全身副作用。
圖5 TSSI納米粒子體內生物安全性評價。A） 不同處理組小鼠超過15d體重變化，C）給藥后15天小鼠血液生化指標，包括肝功能指標（B）和腎功能指標（C）。D） 不同處理15d后主要器官的H&E染色切片圖像。
亮點小結
綜上所述，作者報告了一種基于單一AIE熒光團的全方位光療劑，可同時實現FLI、PAI、PTI、PDT和PTT。得益于AIE分子豐富的分子內旋轉體和振子、扭曲構象和高D-A強度，基于AIE分子的納米粒子可巧妙地實現輻射和非輻射激發(fā)態(tài)能量耗散之間的平衡，在單次660nm激光照射下表現出顯著的NIR-II熒光信號、極高的ROS產生和46%的光熱轉換效率。體外和體內實驗均表明，具有良好生物相容性的AIE 納米粒子在NIR‐II FLI‐PAI‐PTI三模成像引導下的PDT–PTT協(xié)同治療中表現良好，只需一次注射和一次照射即可同時精確地成像腫瘤并完全消除腫瘤。與傳統(tǒng)的all-in-one策略相比，基于AIEgen的one-for-all策略在實現多模式功能和最大化光療效果方面更為直接。
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