光熱療法（PTT）具有空間定向照射、微創(chuàng)和患者痛苦少的優(yōu)勢，有望應(yīng)用于癌癥和皮膚疾病的治療。囊泡光熱治療劑（PTA）的中空結(jié)構(gòu)可以將入射光進(jìn)行多次反射而擁有卓越的光捕獲能力及多功能性，受到廣泛關(guān)注。到目前為止，用作PTA的囊泡多是由脂質(zhì)體等小分子自組裝而成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差。因此，開發(fā)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、光熱轉(zhuǎn)化效率高的囊泡型PTA非常具有挑戰(zhàn)性。
聚合物囊泡具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特點，在PTT的應(yīng)用中具有很大的潛力。但是聚合物囊泡的光熱轉(zhuǎn)化效率差，難以作為PTA應(yīng)用。這是由于脂質(zhì)體的膜流動性比聚合物囊泡高得多，因此脂質(zhì)體的發(fā)色團(tuán)可以形成結(jié)構(gòu)完美的π-π堆積狀態(tài)，而傳統(tǒng)聚合物囊泡則很顯得有心無力，因此光熱轉(zhuǎn)化效率較低。
成果介紹
基于以上分析，上海交通大學(xué)周永豐教授課題組首次提出將共價聚合物自組裝和超分子聚合相結(jié)合制備囊泡的設(shè)想，稱之為“超分子聚合增強(qiáng)的自組裝”（SPESA）過程，并基于超支化的卟啉自組裝制備出了納米聚合物囊泡（THPG）。發(fā)現(xiàn)這種囊泡具有堅固的膜結(jié)構(gòu)和出色的膜流動性，膜內(nèi)的卟啉單元通過定向π-π堆疊，可以形成結(jié)構(gòu)完善的堆積狀態(tài)。在極低的激光功率密度下（200 mW·cm-2），THPG囊泡的溶液溫度從24.1℃可迅速升高至46.8℃，光熱轉(zhuǎn)化效率達(dá)到驚人的44.1％，而且具有優(yōu)異的生物相容性。在對小鼠注射24小時后，THPG囊泡逐漸在腫瘤細(xì)胞內(nèi)聚集，小鼠腫瘤在兩天后形成了焦痂， 14天后自然脫落，而且沒有復(fù)發(fā)，THPG囊泡對MCF-7腫瘤表現(xiàn)出具有優(yōu)異的治療效果。
囊泡自組裝和結(jié)構(gòu)表征
為了制備出囊泡結(jié)構(gòu)，研究者以二環(huán)氧醚為A2單體，以四（4-羥苯基）卟啉鋅（ZnTHPP）為B4單體，進(jìn)行了陰離子聚合反應(yīng)，制備出了兩親性超支化多卟啉聚合物（THPG），分子量為6.4 kDa，分子量分布為1.8。
SEM發(fā)現(xiàn)THPG的超分子聚集體為球形，平均直徑127 nm，從動態(tài)光散射（DLS）獲得的THPG流體動力學(xué)直徑為176 nm。有些納米顆粒破裂后顯示出內(nèi)部的空心腔，表明該顆粒為聚合物囊泡，平均壁厚為約21 nm。THPG在四氫呋喃中的UV-Vis吸收光譜顯示出兩個強(qiáng)吸收區(qū)，分別為B帶（425 nm）和Q帶（從545至626 nm）的卟啉。然而，THPG囊泡在水中的吸收峰明顯加寬，B譜帶紅移至463 nm，Q譜帶延伸至560至650 nm波長，這表明THPG囊泡中卟啉之間的π-π堆積形成了強(qiáng)J聚集體。
研究者詳細(xì)研究了THPG囊泡膜中的分子排列方式，采用高分辨率TEM對破裂囊泡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)疏水性卟啉單元通過π-π相互作用實現(xiàn)了超分子聚合，形成了黑色納米絲，親水性二環(huán)氧醚部分形成了白色條紋，黑色納米絲的平均寬度約9.3?。同步SAXS測量也在q = 1.72和1.56?-1處發(fā)現(xiàn)了兩個尖峰，這是相鄰卟啉單元之間的π-π堆積形成的。
研究者通過分子動力學(xué)（MD）模擬，證實了囊泡的自組裝機(jī)理，發(fā)現(xiàn)卟啉易于通過π-π堆積進(jìn)行有序排列，并呈一定的螺旋角度，兩個卟啉單元之間的分子間距離為3.6??，由于π-π堆積每個卟啉對的平均能量為29.7?kCal·mol-1。
經(jīng)過一系列結(jié)構(gòu)表征和模擬研究，研究者認(rèn)為THPG在水中在疏水相互作用的驅(qū)動下自組裝成膜厚度約為21 nm的囊泡。這種共價聚合物的自組裝過程觸發(fā)了分子內(nèi)或分子間卟啉基團(tuán)的緊密聚集，促使卟啉基團(tuán)進(jìn)行超分子聚合成平均寬度約為9.5?的納米絲，并在π-π堆積的驅(qū)動下形成了少量螺旋J聚集體。本研究首次報道了通過共價和非共價聚合物自組裝過程，誘導(dǎo)形成了獨特的囊泡結(jié)構(gòu)。
囊泡的光熱效率和穩(wěn)定性分析
THPG聚合物在THF中顯示出很強(qiáng)的熒光效應(yīng)，但是在加入水后這一效應(yīng)逐漸衰減，在純水中則完全淬滅。這是由于向THPG/THF溶液中加水后，觸發(fā)了THPG囊泡的自組裝過程。結(jié)果，由于π-π堆積相互作用導(dǎo)致了卟啉的超分子聚合，在囊泡內(nèi)形成納米絲，從而造成熒光自猝滅。但是向THPG囊泡中添加5％Triton X-100清潔劑后，熒光恢復(fù)，這是由于π-π結(jié)構(gòu)被破壞，囊泡分解造成的。
為了研究THPG囊泡的光熱性能，研究者通過紅外熱成像儀記錄了635nm激光照射后囊泡水溶液的溫度變化。發(fā)現(xiàn)即使在非常低的激光功率密度下（200 mW·cm-2），THPG囊泡溶液的溫度仍從24.1℃迅速升高至46.8℃，而PBS溶液的溫度僅升高了2.1℃，這說明THPG囊泡具有優(yōu)秀的光捕獲并轉(zhuǎn)化為熱量的性能，經(jīng)計算發(fā)現(xiàn)THPG囊泡的光熱轉(zhuǎn)化效率高達(dá)44.1％，遠(yuǎn)高于大多數(shù)有機(jī)光熱劑。經(jīng)過635 nm激光的三個加熱和冷卻循環(huán)后，THPG囊泡的平衡溫度依然保持在46.1℃左右，表現(xiàn)出優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性，這與囊泡內(nèi)卟啉之間的強(qiáng)π-π堆積相互作用、多層膜結(jié)構(gòu)以及疏水單元之間的疏水作用密不可分。
囊泡光熱治療劑的體外細(xì)胞評估
研究者通過甲基噻唑基四唑鎓（MTT）對NIH/3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的影響，評估了THPG囊泡在體外的潛在細(xì)胞毒性。發(fā)現(xiàn)即使在濃度高達(dá)0.2 mg·mL-1的THPG囊泡中孵育48 h后，3T3細(xì)胞的相對活力仍保持在86.0％，說明THPG囊泡對NIH/3T3無毒且生物相容性極好。
為了研究癌細(xì)胞對THPG囊泡的內(nèi)化作用，研究者將MCF-7癌細(xì)胞與負(fù)載Rb的THPG囊泡在37℃下孵育，然后利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)隨著孵育時間從15分鐘增加到2 h，在癌細(xì)胞中觀察到THPG-Rb發(fā)出的紅色熒光持續(xù)增加，表明THPG-Rb囊泡被MCF-7細(xì)胞有效的攝取，在激光照射下，MCF-7細(xì)胞對THPG囊泡的攝取大大增強(qiáng)。
研究者進(jìn)行了鈣黃綠素-AM /碘化丙啶（PI）雙重染色MCF-7細(xì)胞實驗，直接的觀察了體外THPG囊泡的PTT性能。發(fā)現(xiàn)攝取THPG后，MCF-7細(xì)胞非常健康。但是，以200 mg·mL-1的濃度與THPG囊泡孵育并用激光照射10分鐘后的MCF-7細(xì)胞，隨著激光功率的增加，死細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。
為了研究THPG囊泡在血液中的保留能力，研究者進(jìn)行了藥代動力學(xué)研究。發(fā)現(xiàn)THPG囊泡的血液循環(huán)半衰期為29.5 h，具有較長的血液循環(huán)能力，這是由于囊泡良好結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性造成的。注射后72小時后，血液中THPG的濃度很低，表明THPG囊泡可以從大鼠體內(nèi)清除掉。
研究者向具有MCF-7腫瘤的小鼠靜脈注射THPG-Cy7.5囊泡（用Cy7.5的近紅外染料包裹的THPG囊泡），進(jìn)行了動物熒光成像實驗。發(fā)現(xiàn)注射24小時后，體內(nèi)游離Cy7.5的熒光信號弱于THPG-Cy7.5囊泡，這表明THPG-Cy7.5囊泡在體內(nèi)的保留時間更長。在注射后24小時后，Cy7.5不會在腫瘤組織中積累，相比之下，THPG-Cy7.5囊泡的熒光信號在腫瘤位置處在24小時后仍然很明顯。
研究者進(jìn)一步研究了腫瘤和其他主要器官中THPG的累積。發(fā)現(xiàn)注射24小時后，在小鼠大多數(shù)器官中THPG含量顯著下降，但是腫瘤中的含量下降不明顯，表明THPG囊泡在24小時后逐漸聚集到腫瘤組織上。
囊泡光熱治療劑的體內(nèi)動物評估
研究者進(jìn)一步研究了THPG囊泡在體內(nèi)的PTT功效。發(fā)現(xiàn)在注射THPG囊泡后，激光照射60秒后，小鼠腫瘤的溫度從35.1℃升高到55.9℃，而對照組的小鼠腫瘤溫度僅從35.3℃略微升高到38.9℃，這說明THPG囊泡光熱傳遞效率非常高。
研究者將THPG囊泡注入小鼠體內(nèi)4小時后，對腫瘤進(jìn)行激光照射10分鐘，研究了腫瘤的演變情況。發(fā)現(xiàn)注射PBS的小鼠腫瘤持續(xù)增加，注射THPG的小鼠腫瘤在兩天后形成了焦痂，它在14天后自然脫落，而且沒有復(fù)發(fā)。
小結(jié)
為了制備出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的PPT光熱治療劑，上海交通大學(xué)周永豐教授課題組基于“超分子聚合增強(qiáng)的自組裝”過程，構(gòu)建用于高效光熱療法的超支化多卟啉囊泡。發(fā)現(xiàn)制備的聚合物囊泡平均直徑為176 nm，具有出色的生物相容性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和膜流動性。在π-π堆積相互作用的驅(qū)動下，囊泡中的卟啉單元可以進(jìn)一步自組裝成納米絲狀超分子聚合物，熒光自猝滅率高達(dá)1100，光熱轉(zhuǎn)化效率達(dá)到驚人的44.1％，在極低的激光功率密度下（200 mW·cm-2），THPG囊泡的溶液溫度從24.1℃可迅速升高至46.8℃。在注射THPG囊泡并激光照射60秒后，小鼠腫瘤的溫度從35.1℃升高到55.9℃，腫瘤在兩天后形成了焦痂，14天后自然脫落，沒有復(fù)發(fā)，所制備的聚合物囊泡對小鼠MCF-7腫瘤細(xì)胞顯示出優(yōu)異的治療功效。
