近日，蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院范增杰教授團(tuán)隊聯(lián)合美國康涅狄格大學(xué)化學(xué)與生物分子工程系孫陸逸教授團(tuán)隊，在國際前沿期刊Advanced Functional Materials(IF=16.836，JCR一區(qū))上發(fā)表了題為“3D Printing Hydrogel Scaffoldswith Nano-hydroxyapatite Gradient to Effectively Repair Osteochondral Defectsin Rats”的研究論文，首次設(shè)計并成功制備了一種具有三層結(jié)構(gòu)的梯度支架，能夠精確地模仿軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨的結(jié)構(gòu)，推動了水凝膠支架在骨軟骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。論文第一單位為蘭州大學(xué)，該論文的第一通訊作者為蘭大口腔醫(yī)學(xué)院范增杰教授，第一作者為其2018級學(xué)術(shù)型研究生張慧。
圖1. 3D打印梯度支架修復(fù)大鼠骨軟骨缺損的流程圖。(A)電子噴霧裝置。(a-c)分別為“0% nHA”、“40% ?nHA”和“70% nHA”墨水。(i)-(iii):骨軟骨區(qū)的淺層(軟骨)、中層(鈣化軟骨)和深層(軟骨下骨)。( SA:海藻酸鈉; CA:海藻酸鈣; ?AM:丙烯酰胺; PAM:聚丙烯酰胺)。
支架作為組織工程的核心組成部分，對骨軟骨再生有著至關(guān)重要的影響。水凝膠和納米羥基磷灰石，是骨軟骨再生的理想仿生支架來源。然而，即使在3D打印技術(shù)的支持下，如何精確地控制其結(jié)構(gòu)使其適合骨軟骨再生仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。本研究制備了由軟骨層（純水凝膠）、模擬鈣化軟骨的界面層（40/60%（w w-1）nHA/水凝膠）和模擬軟骨下骨層的70/30%（w w-1）nHA/水凝膠底層組成的三維支架，該支架具有三層梯度結(jié)構(gòu)，能夠精確地與軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨的生物醫(yī)學(xué)功能相匹配。
支架的制備過程見圖2。該過程可分為三個主要步驟：(1) 三種水凝膠墨水的制備；(2) 3D打印墨水；(3) 先后進(jìn)行光交聯(lián)和Ca2+交聯(lián)。最重要的技術(shù)創(chuàng)新在于應(yīng)用電子噴涂裝置來控制Ca2+的緩慢釋放以防止海藻酸鈣的快速形成，這使得70/30%（w w-1）nHA/水凝膠層的打印成為可能。
圖2. (A)-(C) 分別為“0% nHA”、“40% nHA”和“70% nHA”水凝膠支架材料的合成步驟。
圖3. 各種3D打印支架的照片。(A)從左至右分別為“0% nHA”、“40% nHA”、“70% nHA” (用羅丹明染成紅色) 和“G-nHA”。(B) 3D打印人工半月板的模型: “0% nHA”(a)、 “40% nHA”(b)、“70% nHA”(c)和“G-nHA凝膠(d); (e&f)分別為浸泡在CaCl2溶液前后的圖片。(C)進(jìn)行拉伸測試的水凝膠支架: “0% nHA”(a)、“40% nHA”(b)、“70% nHA”(C)和“G-nHA”(d)的俯視圖，以及(e) “G-nHA”支架的側(cè)視圖。
通過3D打印后，支架不僅保持了原有的外形特征（圖3），而且具有多孔結(jié)構(gòu)和較高的機(jī)械強(qiáng)度（圖4）。通過掃描電鏡觀察到，支架表面呈現(xiàn)出不同的孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑隨著nHA的填充密度的增加而顯著減?。惶荻戎Ъ艿目讖皆?00–800 nm范圍內(nèi)，既能促進(jìn)細(xì)胞的活性，又能促進(jìn)ECM的分泌，有利于對骨軟骨組織的重建。力學(xué)測試表明，梯度支架組拉伸強(qiáng)度為75KPa，壓縮強(qiáng)度達(dá)到了900KPa。這些結(jié)果表明，這種新的研究方法適合于制造具有精確、復(fù)雜和明確外形的天然支架。
圖4. 不同nHA/水凝膠質(zhì)量比的支架材料的表征。A) FTIR光譜；B)XRD圖譜；C)SEM圖像；D)和E)不同支架的拉伸和壓縮強(qiáng)度。
體內(nèi)骨軟骨組織的再生，是預(yù)測臨床可行性應(yīng)用最重要的證據(jù)。將不含有細(xì)胞和載有細(xì)胞的支架分別植入大鼠體內(nèi)，在6和12周的時間點分別評估體內(nèi)骨軟骨再生的可行性(圖5和6)。體內(nèi)大體觀、微CT掃描及組織學(xué)檢查顯示軟骨樣組織穩(wěn)定再生，未見明顯炎癥反應(yīng)，且載細(xì)胞的“G-nHA”組表現(xiàn)出最佳的修復(fù)效果：再生的骨軟骨樣組織較成熟，軟骨層具有典型的軟骨陷窩和軟骨沉積，預(yù)示了其在臨床應(yīng)用中的潛力。
圖5. 大鼠6周和12周后的骨軟骨再生的大體觀和微CT掃描圖像。(紅色矩形表示缺陷區(qū)域;白色箭頭表示未完全降解的支架和骨樣組織的混合物)
圖 6. 大鼠骨軟骨再生的染色分析。(A-G)分別為對照組、BMSCs組、“G-nHA”組、“0% nHA+BMSCs”組、“40% nHA+BMSCs”組、“70% nHA+BMSCs”組、“G-NHA+BMSCs”組。(紅色箭頭:正常組織與再生組織的分界; 黑色箭頭:降解支架留下的缺損區(qū)域)
綜上所述，作者通過物理交聯(lián)、光交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)三種交聯(lián)方法制備出具有精確外部三維形狀(半月板)和良好內(nèi)部孔結(jié)構(gòu)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠支架。在對其進(jìn)行體內(nèi)和體外的一系列測試后，論文證實該支架具有理想的尺寸穩(wěn)定性、多孔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、顯著的力學(xué)性能、合適的溶脹和降解性能以及獲得了最佳的體內(nèi)修復(fù)效果，本研究為基于高分子聚合物的多孔支架的制備提供了一系列策略，并為骨軟骨再生提供了一種新型的天然生物降解支架。
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