近年來,由疾病、外部創(chuàng)傷等原因引起的骨缺損一直是研究熱點(diǎn)和產(chǎn)業(yè)熱點(diǎn)。上市的產(chǎn)品不勝枚舉,在功能上也是各有千秋。所以想在如此成熟的領(lǐng)域再有所斬獲,推陳出新,甚至將其發(fā)表在《Nature?Materials》,難度可見一斑。

骨缺損處需要大量的填充物。根據(jù)經(jīng)典的組織工程三要素理論設(shè)計(jì)的填充支架存在一個(gè)重大挑戰(zhàn)就是種子細(xì)胞植入體內(nèi)后存活率低,這嚴(yán)重影響了其修復(fù)再生的能力。那能不能給細(xì)胞打打雞血?安心骨修復(fù)呢?

倫敦國王學(xué)院干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)中心的研究團(tuán)隊(duì)近日?qǐng)?bào)道了一種新型骨修復(fù)繃帶,以生物可降解的聚己內(nèi)酯(PCL)作為繃帶基材,通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路,實(shí)現(xiàn)人骨骼干細(xì)胞(hSSCs)長期(>8周)存活能力。在大鼠顱骨缺損模型中,經(jīng)修復(fù)后的新形成的骨在結(jié)構(gòu)上可與成熟的皮質(zhì)骨相媲美,并由人(人的細(xì)胞由修復(fù)繃帶負(fù)載植入的)和鼠細(xì)胞組成。該研究精巧地在修復(fù)繃帶上設(shè)計(jì)了一種包含三維Wnt誘導(dǎo)成骨組織模型(WIOTM),介導(dǎo)人骨骼干細(xì)胞不對(duì)稱分裂,同時(shí)產(chǎn)生Wnt-近端骨骼肌干細(xì)胞和易于分化的Wnt-遠(yuǎn)端細(xì)胞,促進(jìn)骨修復(fù)。

Wnt3a誘導(dǎo)細(xì)胞不對(duì)稱分裂,成骨基因差異化表達(dá)

根據(jù)作者前期研究,發(fā)現(xiàn)在Wnt3a蛋白的刺激下,大約53%的骨骼肌干細(xì)胞激活了Wnt?/β連環(huán)蛋白通路(Wnt/β-Catenin通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性,并且在發(fā)育過程中決定細(xì)胞的分化命運(yùn))。有意思的是,與固定化的Wnt3a不同,在可溶性的培養(yǎng)基中加入Wnt3a蛋白可誘導(dǎo)hSSC增殖,但是不促進(jìn)細(xì)胞遷移。研究人員進(jìn)而探究,細(xì)胞的分裂方向與多層形成是否由Wnt3a在hSSCs一側(cè)的不對(duì)稱呈現(xiàn)耦合和調(diào)控的(圖2b,Wnt3a表面上可能的細(xì)胞分裂模式的三維圖示)。研究人員在Wnt3a平臺(tái)上低密度培養(yǎng)hSSCs,并在成骨培養(yǎng)基中加入COL1-gel,利用三維成像顯示了hSSCs中期有絲分裂的方向,發(fā)現(xiàn)存在兩類分裂方式的細(xì)胞。其一,垂直于Wnt3a平臺(tái)且在花狀染色質(zhì)環(huán)的中期排列染色體的細(xì)胞(圖1 d, e);其二,平行于Wnt3a平臺(tái)分裂的細(xì)胞,其染色質(zhì)環(huán)立在邊緣,從上面看是一個(gè)長方形。與此同時(shí),與未被激活Wnt/β-Catenin通路的細(xì)胞相比,作者觀察到垂直于Wnt3a平臺(tái)分裂的細(xì)胞比例顯著增加(圖1c)。除了分裂方式不同,在垂直于Wnt3a -平臺(tái)的分裂中,作者發(fā)現(xiàn)腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白APC、極性蛋白非典型激酶Cζ(紡錘體定向通常需要將極性蛋白不典型蛋白激酶Cζ(aPKCζ)劃分到細(xì)胞的一側(cè))和連環(huán)蛋白catenin主要定位于Wnt3a -近端細(xì)胞(圖1d-g,l)。在平行分裂中,這些蛋白在細(xì)胞的兩半中分布相似 (圖. 1d,g,l)。

在相關(guān)基因表達(dá)上,最近發(fā)現(xiàn)的hSSC標(biāo)記物CDH13和PLXNA2在Wnt3a -近端細(xì)胞中高表達(dá),在遠(yuǎn)離Wnt3a -平臺(tái)的細(xì)胞中下調(diào)(圖2 a,b,c)。然而成骨基因OCN和OPN在Wnt3a -遠(yuǎn)端細(xì)胞中高表達(dá)(圖2 d,f)。在平行于wnt3a平臺(tái)分裂的細(xì)胞中,分裂的細(xì)胞對(duì)之間的干細(xì)胞和分化標(biāo)志物分布是一致的(圖2e,f,i–k)。

因此作者認(rèn)為,在以Wnt3a介導(dǎo)的單個(gè)hSSCs分裂過程中,定位的Wnt3a誘導(dǎo)Wnt3a近端-細(xì)胞中干細(xì)胞命運(yùn)標(biāo)記物的富集,誘導(dǎo)Wnt3a-遠(yuǎn)端細(xì)胞的早期成骨分化標(biāo)志物富集。

?老掉牙的改性PCL骨修復(fù)發(fā)《自然·材料》,有這么簡單?

圖1所示。定位的Wnt3a誘導(dǎo)骨骼干細(xì)胞不對(duì)稱分裂。

?老掉牙的改性PCL骨修復(fù)發(fā)《自然·材料》,有這么簡單?

圖2所示。定位的Wnt3a誘導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)標(biāo)記物在分裂細(xì)胞中不對(duì)稱分布。

生物降解Wnt3a繃帶的制作,驗(yàn)證骨修復(fù)能力

為了將誘導(dǎo)成骨模型(WIOTM,Wnt3a誘導(dǎo)骨骼干細(xì)胞所形成的成骨模型)移植到體內(nèi),研究人員設(shè)計(jì)了一種結(jié)合Wnt3a蛋白生物相容性繃帶,用于移植移植細(xì)胞。他們使用臨床認(rèn)可的聚己內(nèi)酯(PCL)聚合物薄膜,經(jīng)過氧等離子體處理表面,然后用氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)孵育)。?(O2/APTES)為Wnt3a共軛提供了伯胺官能團(tuán)。重要的是,支架上的伯胺官能團(tuán)在室溫下可保持8周穩(wěn)定性。純化的Wnt3a蛋白通過戊二醛共價(jià)結(jié)合到胺基上。

研究人員制備出骨修復(fù)繃帶后,首先用western blot分析驗(yàn)證了Wnt3a成功地共價(jià)結(jié)合到了PCL繃帶上(圖3 a)。同時(shí)為了驗(yàn)證結(jié)合后的Wnt3a活性,作者又進(jìn)行了TCF-熒光素酶報(bào)告細(xì)胞系(LS/L)測(cè)定(TCF是β-catenin通路激活的一個(gè)標(biāo)志性效應(yīng)因子),顯示共價(jià)結(jié)合后的Wnt3a保持了極高的激活β連環(huán)蛋白途徑的能力(圖3 b)。為了驗(yàn)證hSSCs的活性,作者將具有7xTCF-eGFP//SV40-mCherry基因的hSSCs種植在了Wnt3a繃帶上,結(jié)果顯示,接枝了20或60 ng Wnt3a的Wnt3a-PCL的hSSCs顯示eGFP表達(dá)的增強(qiáng)呈劑量依賴性,而iWnt3a-PCL和牛血清白蛋白-PCL (BSA-PCL)對(duì)照顯示eGFP的基礎(chǔ)水平表達(dá)(圖3c,d)。eGFP表達(dá)受7xTCF結(jié)合位點(diǎn)控制,mCherry顯示紅色熒光,在細(xì)胞中是組成性共表達(dá)。

?老掉牙的改性PCL骨修復(fù)發(fā)《自然·材料》,有這么簡單?

圖3。Wnt3a -繃帶的體外功能研究

研究人員以大鼠顱骨缺損為模型,驗(yàn)證繃帶的體內(nèi)修復(fù)的效果。植入修復(fù)八周后,微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(μCT)分析結(jié)果顯示,由Wnt3a繃帶覆蓋的缺損部位表現(xiàn)出明顯的新骨形成,而WIOTM繃帶組表現(xiàn)出更多的骨形成,為Wnt3a繃帶組的近兩倍(圖 4c,d)。組織學(xué)染色評(píng)價(jià)表明,WIOTM繃帶組的缺損部位新形成的骨礦化區(qū)域顯示了健康骨的組織學(xué)特征,其中核被拉長且稀疏分布,此外,周圍的鈣化組織呈現(xiàn)條紋,這是板層骨的特征(圖4e,f)。連接缺損的結(jié)締組織/間質(zhì)樣組織顯示出密集的細(xì)胞核(圖4e)。在Wnt3a和WIOTM繃帶組處理的缺損中,缺損部位中段和缺損邊緣均有新骨形成,表明在修復(fù)和再生過程中,新骨與已有骨融合(圖4e)。新形成的骨內(nèi)血管也被檢測(cè)到(圖4f)。

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圖4。Wnt3a和WIOTM繃帶在修復(fù)骨缺損中的體內(nèi)功能評(píng)價(jià)。

小結(jié)

最后,研究者得出結(jié)論,接枝了Wnt3a的修復(fù)繃帶打破了細(xì)胞分裂過程的對(duì)稱性,使hSSCs分裂形成富集早期成骨分化基因的Wnt3a -遠(yuǎn)端細(xì)胞和富集了連環(huán)蛋白、APC、細(xì)胞極性蛋白aPKC和干細(xì)胞標(biāo)記物的Wnt3a -近端細(xì)胞。該種設(shè)計(jì),即WIOTM繃帶,能同時(shí)維持損傷部位的人的hSSCs和成骨細(xì)胞,加速骨修復(fù)。植入體內(nèi)后顯示出了極佳的骨修復(fù)效果。

該研究成果以題為“Wnt-modified materials mediate asymmetric stem cell division to direct human osteogenic tissue formation for bone repair”的論文發(fā)表在《Nature Materials》上(見文后原文鏈接)。文章第一作者為Yoshihisa Okuchi,通訊作者為倫敦國王學(xué)院干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)中心的 Shukry J. Habib教授。

全文鏈接:

https://www.nature.com/articles/s41563-020-0786-5#Sec32

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