脊髓損傷（SCI）是一種嚴(yán)重影響軀體功能的疾病，目前臨床上尚無基于受損脊髓再生的療法。脊髓損傷給患者及其家人帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)，身體和情感負(fù)擔(dān)。基于細(xì)胞的療法已成為鼓勵脊髓損傷后再生和功能恢復(fù)的有前途的方法。目前，美國食品和藥物管理局針對胸部和宮頸水平為脊髓損傷的患者正在研究自體人施旺細(xì)胞（SCs）的移植 (圖1)。人施旺細(xì)胞是在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的膠質(zhì)細(xì)胞，其在周圍神經(jīng)損傷后促進(jìn)軸突再生。在過去的二十年中，數(shù)項臨床前研究表明，人施旺細(xì)胞在直接遞送至損傷部位后形成的病變腔中后可促進(jìn)脊髓損傷后的再生。與可能的多能干細(xì)胞脊髓損傷再生療法相比，施旺細(xì)胞的純度高，特征明確，并且相對容易從患者腓腸神經(jīng)中分離和擴(kuò)增。不幸的是將SCs直接局部注射到脊髓損傷中會導(dǎo)致大量移植的細(xì)胞丟失和死亡。在注射過程中，通常多達(dá)60％的細(xì)胞甚至無法到達(dá)目標(biāo)部位。這可能是由于多種因素共同作用的結(jié)果，包括注射過程中細(xì)胞膜的損傷和脊髓中細(xì)胞的回流。此外，已有研究表明，細(xì)胞注射10分鐘后移植細(xì)胞的死亡便迅速發(fā)生，導(dǎo)致SC生存期較差。通常，只有約20％的細(xì)胞在1周后存活，而不到5％的移植SC在移植后1個月存活，但是由于脊髓損傷病變中的移植體積有限，僅增加注射細(xì)胞的數(shù)量是不可行的。
針對上述對于細(xì)胞治療脊髓損傷遇到的問題，斯坦福大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院Sarah C.?Heilshorn?教授課題組在Science Advance發(fā)表文章提出使用可注射高分子水凝膠材料策略來解決阻礙脊髓損傷移植期間SC存活的三個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。
在這項研究中，作者們使用使用可注射高分子水凝膠材料解決阻礙脊髓損傷移植期間SC存活的三個關(guān)鍵挑戰(zhàn)（圖2）。在細(xì)胞遞送過程中，細(xì)胞損失是由（i）注射期間的拉伸力引起的細(xì)胞膜損傷和（ii）注射部位細(xì)胞的回流和滲漏引起的細(xì)胞流失。注射后不久，（iii）病變組織內(nèi)缺乏細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），進(jìn)一步降低了注射細(xì)胞存活率，導(dǎo)致依賴于貼壁生長的SCs的凋亡。因此，要使移植的細(xì)胞能夠與周圍的內(nèi)源性組織相互作用并促進(jìn)長期修復(fù)，細(xì)胞治療必須首先克服這三個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。
本文系統(tǒng)展示了水凝膠材料中設(shè)計了三個不同的特征，并且提出新策略以解決上述移植細(xì)胞存活的三個關(guān)鍵挑戰(zhàn)：（i）剪切力流變性以保護(hù)細(xì)胞膜在注射過程中不受損害；（ii）快速自我修復(fù)和原位硬度提升以穩(wěn)定注射到脊髓損傷病變部位內(nèi)的細(xì)胞，以及（iii）促進(jìn)SC附著和添加促進(jìn)細(xì)胞粘附性配體。
具體步驟：
1、可注射水凝膠的設(shè)計
水凝膠第一階段發(fā)生在重組蛋白（C7）和與富含脯氨酸的肽結(jié)合的多臂聚乙二醇（PEG）-聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）共聚物之間形成物理交聯(lián)（圖3，B和C）。這兩個組分通過兩個肽結(jié)構(gòu)域（CC43 WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的肽）的可逆異二聚體結(jié)合異位組裝，從而形成帶有包封的SC的弱凝膠。當(dāng)凝膠受到作用力時，肽-肽鍵斷裂，使材料剪切稀薄并以液體形式流動。消除作用力后，肽-肽鍵迅速重整，使凝膠快速自愈。
水凝膠交聯(lián)的第二階段發(fā)生在原位注射后，用以穩(wěn)定和提升凝膠硬度從而防止細(xì)胞擠出和從病變部位中流失。在高于PNIPAM最低臨界溶液溫度32°C的體溫下，聚合物會發(fā)生分子內(nèi)氫鍵作用力交聯(lián)，從而提供二次物理交聯(lián)來加強(qiáng)和增強(qiáng)水凝膠網(wǎng)絡(luò)（圖3B）。由于目前尚不清楚在脊髓損傷病變內(nèi)能否保留可行的已移植SC的理想凝膠硬度，因此本文配制了具有一定范圍的熱響應(yīng)性PNIPAM聚合物的材料，分別得到了軟凝膠，中等硬度凝膠和高硬度凝膠（圖3D）。這些材料涵蓋了脊髓損傷病變的報道的神經(jīng)組織硬度的大致范圍。
2、可注射水凝膠為注入的SC提供細(xì)胞膜保護(hù)。
當(dāng)在注射針頭注射過程中受到拉伸力時，細(xì)胞會受到膜的破壞（圖2A）。假設(shè)即使在注射的流速非常慢時（500 nl / min）也會發(fā)生這種情況，因為溶液線速度的大小變化由注射器針頭裝置的幾何形狀決定。當(dāng)細(xì)胞從注射器筒?[內(nèi)徑（ID）= 0.485 mm]?進(jìn)入超小針頭（33號，ID = 0.11 mm）時，流體線速度增加了20倍。為了評估設(shè)計的水凝膠材料在移植過程中保護(hù)SC免受細(xì)胞膜損傷的能力，本文使用體內(nèi)移植研究（材料和方法）中所述的相同注射參數(shù)。當(dāng)細(xì)胞在生理鹽水或C7 RGD聚合物的粘稠溶液（5 wt％）中遞送時，觀察到很明顯的細(xì)胞膜損傷（分別為25％和20％）。將C7 RGD聚合物與PEG-P-PNIPAM聚合物（均以5 wt％的最終濃度混合）可以產(chǎn)生剪切稀化的快速自修復(fù)水凝膠（圖4C），改變凝膠配方中細(xì)胞粘附配體或PNIPAM的量不會改變剪切稀化的凝膠行為（圖4C）。將這些SC預(yù)先封裝在這些水凝膠變體中，可在注射針頭流動期間提供顯著的細(xì)胞膜保護(hù)（圖4，A和D）。與在鹽水中遞送細(xì)胞相比，軟，中等硬度的水凝膠具有更高水平的細(xì)胞保護(hù)。材料中是否存在RGD細(xì)胞粘附域也不會影響細(xì)胞膜保護(hù)并且觀察到單獨(dú)的C7 RGD聚合物無法提供保護(hù)。這些數(shù)據(jù)表明，凝膠的剪切稀化/自修復(fù)特性（而不是凝膠細(xì)胞的粘合特性）是可注射水凝膠能夠提供細(xì)胞膜保護(hù)的原因。
3 、注射水凝膠增加了移植的SC保留和擴(kuò)散形態(tài)。
本文在雌性Fischer 344大鼠中選擇了單側(cè)頸挫傷脊髓損傷模型，以代表患者中最常見的脊髓損傷。在進(jìn)行背側(cè)椎板切除術(shù)后在第五個頸椎（C5）水平上進(jìn)行了右側(cè)的75-kdyne挫傷（圖5A）。在移植后48小時（N = 10）和4周（N = 16）評估移植的SC保留率。與體外移植模型數(shù)據(jù)一致，當(dāng)在水凝膠中遞送時，與鹽水相比在病變部位觀察到的P75 +細(xì)胞數(shù)量明顯增加（圖5D）。在第48小時，在水凝膠注射的動物中觀察到32,000±7700個存活的移植細(xì)胞而接受生理鹽水注射的動物中發(fā)現(xiàn)4300±2500存活的移植細(xì)胞。在第4周，觀察到可注射水凝膠遞送了29,000±8000個活細(xì)胞，而鹽水遞送的動物計數(shù)了2400±800個活細(xì)胞，與鹽水相比，活細(xì)胞的局部遞送增加了約10倍。在兩個時間點的脊髓橫截面中與鹽水遞送相比觀察到了較多的SC遞送（圖5E）。結(jié)合本文的體外數(shù)據(jù)，這些觀察結(jié)果表明，使用剪切稀化的自修復(fù)水凝膠可通過在注射過程中提供細(xì)胞膜保護(hù)并限制細(xì)胞從注射部位滲出從而顯著改善SC向脊髓損傷病變部位的遞送。
4、水凝膠介導(dǎo)的細(xì)胞遞送增加功能恢復(fù)
本文評估了組合細(xì)胞和可注射水凝膠療法對功能性前肢恢復(fù)的作用。進(jìn)行運(yùn)動和感覺運(yùn)動測試均可以獲得更正確的右前肢功能圖，因為挫傷性脊髓損傷可導(dǎo)致運(yùn)動和感覺缺陷。為了評估前肢運(yùn)動恢復(fù)，本文測量了前肢的抓地力，例如評估組合的力量和右臂力量用以評估左臂補(bǔ)償是否影響右臂行為。結(jié)果表明，單側(cè)C5挫傷會同時導(dǎo)致合并和右前肢握力下降，并且在僅右前臂的測試中這種下降明顯更大（圖6，A和B）。在合并前肢和右前肢評估中，觀察到與僅損傷對照組相比在可注射水凝膠中用SC進(jìn)行治療的動物的抓地力顯著增加（圖6，A和B）。此外，在接受注射水凝膠治療的動物中，SC的右前肢握力明顯高于生理鹽水中的SC（圖6，A和B），但是在鹽水中用SCs處理的動物沒有觀察到明顯的改善。本文還通過水平梯步走試驗評估了動物的感覺運(yùn)動恢復(fù)。該方法通過計算動物橫穿間隔不均勻的橫梯時前臂錯過的步數(shù)來測量前肢的協(xié)調(diào)性，觀察到頸挫傷后脊髓損傷遺漏的步驟明顯增加（圖6C）。
總結(jié)與展望:
本文系統(tǒng)探究了新型設(shè)計的可注射水凝膠與生理鹽水遞送的臨床標(biāo)準(zhǔn)相比，讓注射的細(xì)胞在病變部位的保留能力有了顯著改善。大量的表征結(jié)果表明，可以通過使用水凝膠系統(tǒng)的模塊化設(shè)計，例如水凝膠與細(xì)胞粘附多肽進(jìn)行組合從而通過完整系統(tǒng)的探究來進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化以進(jìn)一步提高細(xì)胞存活率。此外，在本研究報告了細(xì)胞加水凝膠聯(lián)合療法對脊柱再生和功能恢復(fù)的使用。未來繼續(xù)進(jìn)行注射水凝膠優(yōu)化的實驗機(jī)會凸顯了新型可注射水凝膠的應(yīng)用潛力，不僅可用于脊髓損傷的治療，還可用于具有類似局限性的許多其他臨床適應(yīng)癥。最后，雖然該研究集中在針對SC注射移植而設(shè)計的水凝膠的使用，但本研究對于使用其他細(xì)胞類型治療脊髓損傷具有更廣泛的意義。
參考文獻(xiàn)
Marquardt L M,?Doulames?V M, Wang A T, et al. Designer, injectable gels to prevent transplanted Schwann cell loss during spinal cord injury?therapy[J]. Science Advances, 2020, 6(14): eaaz1039.
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